3º FICHAMENTO

Validação de métodos laboratoriais aplicadas a análises com marcadores microssatélites

Tiago Silva Oliveira; Lucia Vieira Hoffmann,*; Poliana Ferreira Alves; Valeska Silva Lucena; João Luís da Silva Filho

http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1806-66902010000200016&lng=pt&nrm=iso

“A troca de informação sobre biodiversidade e a utilização de recursos genéticos podem ser melhor realizadas se os laboratórios que geram as informações puderem demonstrar que seus resultados são confiáveis através de metodologias adequadas de validação.”

“Marcadores microssatélites, também conhecidos como sequências simples repetidas, ou simplesequencerepeats (SSR), são uma ferramenta adequada e importante em genética de plantas, por serem abundantes e uniformemente distribuídos por todo genoma, codominantes e multialélicos (OLIVEIRA et al., 2006; OLIVEIRA E SILVA, 2008). Têm sido utilizados para estudar diversidade de populações naturais (BARROSO et al., 2010; BRONDANI et al., 2005) e de espécies cultivadas (ALMEIDA et al., 2009; ALVES et al., 2009; CRESTE et al., 2004), além de mapeamento molecular.”

“A validação de metodologias desenvolvidas em laboratórios é efetuada após seleção, desenvolvimento e otimização dos métodos (SWARTZ; KRULL, 1997), sendo destacada pelas normas internacionais, nacionais e sistema de qualidade, como um procedimento importante para a obtenção de resultados confiáveis ao uso pretendido.”

“Para extração de DNA de sementes, a quantidade aproximada de 50 mg de sementes de algodoeiros foram moídas em tubos de 2,0 mL contendo uma esfera de 3 mm de diâmetro. Adicionou-se 700 µL de tampão de extração composto por SDS 0,5% (p/v), 288 mMdeNaCl, 25 mM de EDTA, 200 mM de Tris HCl (pH 7,5). As amostras foram centrifugadas a 11.700 g por 7 minutos e os sobrenadantes foram transferidos para tubos novos.”

“A comparação entre as quantidades estimadas de DNA por 5 diferentes avaliadores, e seus valores reais, estão apresentados na Tabela 1. Para este ensaio, foi extraído DNA de sementes de algodão de um genótipo de Gossypium barbadense, cultivar VH8-4602 (McDONALD et al., 1994).”

“A quantidade de 100 ng de DNA pôde ser diferenciada da quantidade de 150 ng em 33 das 35 avaliações, exceto uma vez que foi quantificada como 150 ng e outra como 200 ng (Tabela 1). Entretanto, também pela Tabela 1, o valor de 150 ng foi em 27% das estimativas confundido com 200 ng.”

“A mensuração da repetitividade do método da amplificação de DNA por primers que amplificam locos microssatélites, estimada pela intensidade das bandas obtidas a partir da amplificação de 50 reações utilizando DNAs extraídos de sementes dos algodoeiros, G. hirsutum variedade Guanzuncho-2 e Gossypium barbadense variedade VH8-4602, em reações independentes, está apresentada na Tabela 3.”

“As estimativas do número de pares de bases de cada banda do marcador de peso molecular após a análise de regressão de melhor ajuste, para cada caso, fornecida pelo programa TableCurve 2, estão apresentadas na Tabela 4.”

“1. A precisão da quantificação de DNA varia com a quantidade de DNA mensurada.”